导读
二氧化硫(SO2)在调理细胞凋亡和炎症中起到重要效果。但是，细胞内的小生物分子之间存在杂乱的相互效果，怎么辨认这些共存的生物标志物依然是一个应战。在此，华东理工大学朱为宏、王成云、郭志前课题组报导了一种依据逻辑与的荧光探针(NY-Lyso)，它经过呼应细胞内细胞器之间的pH差异、挑选性与亚硫酸氢盐(HSO3-)反响来作业。这种办法使探针的荧光在中性或碱性条件下坚持沉默，在低pH和亚硫酸氢盐的共影响下激活。此外，它还被证明具有生物相容性，可用于监测活细胞溶酶体中的HSO3-。该办法在方针监测和实时监测方面具有较强的实用性和杰出的才能，为生物标志物的检测供给了一种有用的光学东西。（DOI:10.1021/acs.analchem.9b02749）
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文章提出了一种新的依据逻辑与的荧光探针(NY-Lyso)，它由吗啉基、半花菁苷和1,8-萘二甲酰亚胺显色团组成，用于特异性检测溶酶体中的亚硫酸氢盐。该智能探针由两个功用部件组成：NY-Lyso探针上的吗啉基对细胞内溶酶体(pH 4.5 - 5.5)和其他细胞器之间的pH差异发生灵敏反响，噻吩和花菁之间的碳碳双键经过亲核加成挑选性地与HSO3-反响。
吗啉基和半花菁苷均能经过光诱导电子搬运(PET)和分子内电荷搬运(ICT)机制独立淬灭发射，因而探针无荧光。当一起存在SO2和H+时，探针在524 nm处表现出激烈的荧光发射。也就是说，只有当SO2和pH一起被认为是“输入”时，荧光发射才会被“输出”。值得注意的是，依据该办法的探针不只具有高挑选性、快速呼应(小于200 s)、极低的检测限(LOD = 20.7 nM)和优秀的溶酶体靶向性的长处，并且克服了在杂乱的细胞pH环境中检测HSO3 的局限性。与曾经报导的用于SO2衍生物的生物探针比较，依据逻辑与的荧光探针在功用和应用上都有显着的优势。
图一. NY-Lyso的化学结构及其对HSO3-的传感机理(图片来历：Anal. Chem. 2019, 91, 11946 11951)
探针由两个功用部件组成:溶酶体靶向基团吗啉基和亚硫酸氢盐的特异性结合位点。该规划战略答应探针一起具有两个呼应位点，别离经过PET和ICT操控萘酰亚胺荧光团的荧光。在亚硫酸氢盐存鄙人，半花菁苷的共轭结构被损坏，经过按捺ICT进程导致荧光强度的部分增强。当将SO2探针复合物暴露在酸性环境中，如溶酶体，吗啉基团将被质子化，PET进程也被阻断，然后导致发射强度显着添加。
因为溶酶体pH值在4.5到5.5之间，作者首要研讨了在HSO3-存在和不存在的情况下，pH值对探针NY-Lyso光物理性质的影响。如预期的那样，成果标明pH对探针的效果非常重要。pH = 7.0时，在没有HSO3-的情况下，NY-Lyso因为PET和ICT不宣布荧光。当参加HSO3-时，发射强度依然坚持在一个较低的值，阐明PET进程依然在起效果。当pH值下降到6.0，对吗啉基团内的N原子的质子化效果阻止了PET的效果,导致了在524 nm(Φf= 0.49)呈现显着的发射增强。跟着体系酸度的添加，HSO3-会优先被H+捕获，导致亲核加成进程受阻，ICT进程被从头激活。为了验证这一机理，作者测验了一系列萘酰亚胺模型的光物理性质。这些成果标明，NY-Lyso可作为pH活化荧光探针用于检测HSO3-，在中性和碱性条件下坚持沉默，在弱酸性条件下挑选性荧光激活。随后，经过丈量NY-Lyso在PBS溶液(10mm, 5% DMSO, pH = 5.5)中的吸收和荧光光谱改变，检测其对HSO3-的光学呼应。探针NY-Lyso(10μM)显现首要吸收在475nm。参加HSO3-(0 10当量)后，475 nm处的峰值逐步减小，色彩由淡黄色变为无色。这些改变或许是因为HSO3-阻断了半花菁苷的共轭结构，然后阻断了ICT通路，因而探针的吸收光谱发生了显着的蓝移。且NY-Lyso(10 μM)几乎没有荧光发射。跟着HSO3-浓度的添加，在380 nm激发下，524 nm处呈现显着的荧光。当十倍当量HSO3-添加时,荧光强度到达最大。此外，经过剖析探针在524 nm处的荧光强度，研讨了探针的反响动力学。在不同浓度的HSO3-(0- 60 μM)的条件下，跟着反响时间逐步添加，探针的荧光强度也逐步添加,并在200 s到达平衡,并能够坚持超越60分钟的安稳。试验标明，该探头对SO2的呼应速度快，可用于SO2的实时成像。
图二. PBS溶液(10mM,5% DMSO, pH = 5.5)中NY-Lyso(10 μM)在不同浓度的HSO3-(0-100μM)下的紫外光谱改变以及荧光光谱改变(图片来历：Anal. Chem. 2019, 91, 11946 11951)
依据上述成果，作者经过记载四种或许输入条件下的荧光光谱，确认了探针在PBS缓冲液中的逻辑与特性。其间，H+和HSO3-为输入，体系524 nm处的发射强度为输出。关于输入，存在和不存在H+或HSO3-别离界说为“1”和“0”。输出荧光“ON”和“OFF”别离界说为“1”和“0”。当有两个输入(1/1)时，荧光强度急剧添加，输出信号为“1”。不然，在其他情况下(没有输入或仅输入一个1)，荧光输出为“0”。
图三. 具有两个输入值的逻辑与门的逻辑计划和真值表(图片来历：Anal. Chem. 2019, 91, 11946 11951)
在细胞外酸性条件下，NY-Lyso对亚硫酸氢盐具有杰出的光物理特性和呼应功用，因而作者持续探究NY-Lyso对活细胞溶酶体中亚硫酸氢盐成像的才能。作者首要对探针进行细胞毒性试验，探针对HeLa细胞的细胞毒性较低，阐明NY-Lyso适用于活体细胞成像。与其他含有吗啉基团的溶酶体靶向探针类似，引进吗啉基团显着添加了探针在溶酶体富集的或许性。为了研讨NY-Lyso的溶酶体靶向性，进行了共定位试验。HeLa细胞与探针NY-Lyso(10 μM), HSO3-(20 μM)和Lyso-Tracker(0.5 μM)在室温下一起孵育30分钟。如图4所示，细胞在显微镜下显现了来自NY-Lyso的绿色荧光通道，以及来自商业Lyso-Tracker的赤色荧光通道。兼并后的图画显现两个通道堆叠杰出，Pearson共定位系数为0.85，证明NY-Lyso能够在活细胞溶酶体中特异性定位。随后，研讨了探针对细胞内HSO3-的检测和成像才能。为了测验探针在细胞中的逻辑与特性，作者有必要首要调理细胞表里的pH值。一种常用的办法是运用高钾离子缓冲液将细胞的外部pH值保持为一个固定值，然后运用一种K+/H+离子载体的尼日利亚菌素将细胞内部的pH值调理到相同的pH值。此外，别离用20 mM柠檬酸和20 mM HEPES制备pH为5.5和7.4的缓冲液。那么关于H+，pH值在5.5和7.4能够别离界说为1和。HSO3-HSO3的存在和不存在也别离界说为1和。如图5所示，作者将细胞分为(1,0)、(0,1)、(1,1)三组，但在未处理的细胞和仅与HSO3-孵育的细胞中，细胞上没有荧光。比较之下,用50μM HSO3-孵化后细胞在pH值5.5成功地观察到524 nm的激烈绿色荧光。经过与细胞外试验成果的比较，作者成功地研发了一种依据逻辑与的荧光探针，用于活细胞中HSO3-的挑选性检测。
图四.不同的pH值下NY-Lyso (10 μM)在HeLa细胞中对HSO3-成像的逻辑与行为 (图片来历：Anal. Chem. 2019, 91, 11946 11951)
总结：综上所述，华东理工大学朱为宏、王成云、郭志前课题组开发了一种依据逻辑与的荧光探针NY-Lyso，经过PET和ICT机制的调控来检测HSO3-。该探针对HSO3-具有较高的挑选性和灵敏性(LOD = 20.7 nM)。探针的逻辑与行为答应其荧光在中性或碱性条件下坚持沉默，但被低pH和HSO3-的共影响激活。此外，它被证明具有生物相容性，可用于监测活细胞中的溶酶体HSO3-。与传统探针比较，该探针和依据逻辑与的探针避免了细胞环境中杂乱的相互效果，具有更好的挑选性和更高的灵敏度。该办法具有较强的可完成性和实时性。
补白：逻辑代数有与、或、非三种根本逻辑运算。它是按必定的逻辑关系进行运算的代数，是用来剖析和规划数字电路的数学东西。有三种最根本的逻辑运算：
（1）逻辑与：当A，B都为1时，其值为1，不然为零；
（2）逻辑或：当A，B都为时，其值为，不然为1；
（3）逻辑非：当A=0时，A的非为1，A=1时，A的非为。
撰稿人：冯虹
